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產(chǎn)品描述

廈門模基生物人肝膽管類器官培養(yǎng)基套裝（擴(kuò)增）是一種化學(xué)定義的細(xì)胞培養(yǎng)基，用于建立和培養(yǎng)從成體干細(xì)胞衍生的人肝膽管類器官。肝膽管的自我更新上皮細(xì)胞是由位于肝臟的干細(xì)胞及其祖細(xì)胞的增殖所驅(qū)動(dòng)的。肝膽管類器官因其上皮在結(jié)構(gòu)、細(xì)胞類型組成和自我更新動(dòng)力學(xué)方面的表現(xiàn)，而具有真實(shí)器官的特征。肝膽管類器官可以在分化培養(yǎng)基中誘導(dǎo)出肝樣細(xì)胞，為人類肝臟發(fā)育和疾病的研究提供了前所未有的模型。

產(chǎn)品信息

其他自備材料和試劑

MG&ABW基質(zhì)膠

組織消化液

上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基

類器官消化液

人肝膽管(擴(kuò)增)類器官培養(yǎng)基

類器官冷凍保存培養(yǎng)基(無(wú)血清)  

DPBS (1X)，液體，不含鈣和鎂  

FBS（胎牛血清）

EDTA

人肝膽管類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基的制備

采用無(wú)菌技術(shù)制備人肝膽管類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基和穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基。在人肝膽管類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的人肝導(dǎo)管類器官絕大多數(shù)是膽管細(xì)胞。

以下是準(zhǔn)備 10mL 完全培養(yǎng)基的示例，如所需量不同，可相應(yīng)調(diào)整用量。

1.冰上解凍人肝膽管類器官培養(yǎng)因子B、人肝膽管類器官培養(yǎng)因子C。

注意： 解凍后，建議將人肝膽管類器官培養(yǎng)因子B、人肝膽管類器官培養(yǎng)因子C分別分裝后保存取用，避免反復(fù)凍融。

2. 配制人肝膽管類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，專門用于原代培養(yǎng)和復(fù)蘇。添加200 μL人肝膽管類器官培養(yǎng)因子B (50x)、40 μL人肝膽管類器官培養(yǎng)因子C (250x)至9.76 mL人肝膽管類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，混合均勻。

注意：配制后的人肝膽管類器官培養(yǎng)基可在 2-8°C 儲(chǔ)存，建議在兩周內(nèi)使用。人肝膽管類器官培養(yǎng)因子B(50x)內(nèi)含有細(xì)菌及真菌抗生素(50x)。

人肝膽管(分化)類器官的培養(yǎng)

 人肝膽管類器官原代培養(yǎng)

注意：涉及主要人體組織材料的研究必須遵循所有相關(guān)的機(jī)構(gòu)和政府法規(guī)。在收集主要人體組織材料之前，必須獲得所有受試者的知情同意。

從初級(jí)組織中建立類器官

1. 使用離心管將原代人肝膽管組織收集在冰冷的原代組織儲(chǔ)存液中，將組織樣本保存在4°C，直到開始分離。

2. 評(píng)估獲得的組織碎片是否完全由上皮組織組成。如果存在脂肪或肌肉組織，請(qǐng)?jiān)诮馄曙@微鏡下使用手術(shù)剪刀或手術(shù)刀和鑷子盡可能多地去除這些非上皮成分。如果沒有脂肪或肌肉組織，請(qǐng)立即繼續(xù)下一步。

3.用上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基或DPBS沖洗肝膽管組織，直到上清澄清。

4. 在腺窩結(jié)構(gòu)分離之前，將基質(zhì)膠解凍并保持低溫。加入5 mL FBS至45 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中制備10%FBS培養(yǎng)基。

5. 將組織在細(xì)胞培養(yǎng)皿中使用外科剪刀或手術(shù)刀切成5mm³的小碎片。

注：分離的樣品必須足夠小，能夠通過(guò)10ml移液管的尖端。

6.將分離的樣品放入一個(gè)15毫升的離心管中，管中含有10ml預(yù)冷的DPBS。

7.用10ml移液管清洗樣品至少10次。

注：在接下來(lái)的步驟中，使用10%FBS培養(yǎng)基潤(rùn)洗10ml移液管的內(nèi)表面以避免樣品粘在移液管壁上。

8.讓管子靜止不動(dòng)，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清液，加入10mL預(yù)冷DPBS。

9. 重復(fù)步驟7和8 3-5次，直到上清完全清澈。

注：徹底清洗樣品是避免細(xì)菌污染的關(guān)鍵。

10. 向試管中加入10ml預(yù)冷DPBS，并加入2.5 mM EDTA 。把管子放在搖床上，在4°C的溫度下輕輕搖動(dòng)40分鐘。

11. 用EDTA處理后，保持試管靜止，直到樣品沉淀到試管底部，然后用10ml移液管取上清液，加入10ml預(yù)冷DPBS。

12. 讓管子靜止不動(dòng)，直到樣品沉淀到底部。用10ml移液管吸出上清。

13. 加入10ml預(yù)冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。隱窩結(jié)構(gòu)會(huì)通過(guò)移液吸頭釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入新的15ml管中。

14. 加入10ml預(yù)冷DPBS，用10ml移液管上下吹吸至少10次。允許組織碎片在正常重力下下沉至少30秒鐘。隱窩被通過(guò)移液釋放到上清液中。將含有分離的隱窩的上清液放入一個(gè)新的15ml管中。

15. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

16. 將沉淀重懸在1ml DPBS中，并將隱窩懸浮液轉(zhuǎn)移到新的1.5 mL管中。滴20 μL隱窩重懸液到培養(yǎng)皿中。在立體顯微鏡下計(jì)數(shù)隱窩的數(shù)量并計(jì)算隱窩的總數(shù)。

17. 在4℃、400g條件下離心3分鐘。吸出并丟棄上清。

18. 吸取上清，將沉淀重懸于基質(zhì)膠中?；|(zhì)膠應(yīng)保存在冰上以防止固化。推薦重懸密度為每 25 μL基質(zhì)膠懸液包含 100 - 500 個(gè)隱窩，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過(guò) 30 s 以避免基質(zhì)膠過(guò)早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過(guò)程中 基質(zhì)膠 的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

19. 將基質(zhì)膠和組織細(xì)胞小心均勻混合以防止氣泡產(chǎn)生并將懸液加入 24 孔板，30 μL每孔滴加在孔底中心，避免

懸液接觸孔板側(cè)壁。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

20. 將接種完成后的培養(yǎng)板置于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15 -25min 左右待基質(zhì)膠凝固后取出。

21. 每孔沿孔壁加入 500 μL 提前預(yù)熱的人肝膽管類器官擴(kuò)增培養(yǎng)基，再向 24 孔板最外周孔中每孔加入 500 μL 無(wú)菌水， 置于 37℃溫箱、5% CO2條件下培養(yǎng)。

注意：請(qǐng)沿孔壁緩慢加入，避免破壞已凝固結(jié)構(gòu)。

22. 每 3 d 更換一次培養(yǎng)基，從孔中小心地吸出培養(yǎng)基，并用新鮮的、預(yù)熱過(guò)的有機(jī)完全培養(yǎng)基替換，更換培養(yǎng)基時(shí)應(yīng)避免破壞基質(zhì)膠。

23. 密切監(jiān)測(cè)類器官生長(zhǎng)狀態(tài)，理想情況下人類肝膽管類器官應(yīng)在 5 - 8 天內(nèi)建成。

人肝膽管類器官傳代培養(yǎng)

1. 用經(jīng)過(guò)潤(rùn)洗液潤(rùn)洗的槍頭吹打刮取類器官，并將類器官和培養(yǎng)基的懸液轉(zhuǎn)移至經(jīng) 過(guò)潤(rùn)洗液潤(rùn)洗的 1.5mL EP 管中。

2. 用經(jīng)過(guò)潤(rùn)洗液潤(rùn)洗的槍頭用力重懸類器官懸浮液，使得類器官與基質(zhì)膠分離。

3.250g 離心力室溫離心 3min。

4.棄上清，使用類器官消化液或用機(jī)械破壞。對(duì)于使用類器官消化液的細(xì)胞解離，在類器官消化液中重懸類器官懸浮液，移液器反復(fù)上下吹打并置于37°C孵育，直至類器官解離。使用帶濾芯移液頭每2分鐘反復(fù)上下吹吸8次，以幫助破壞類器官。密切監(jiān)視消化過(guò)程使在類器官解離液中的孵育時(shí)間最短。如發(fā)生機(jī)械故障，在1.5 mL上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基中重懸類器官懸液。小心地用移液管吸取類器官懸浮液，反復(fù)上下30次，這將有助于消化。

警告:不要在類器官消化液中解離超過(guò)3分鐘，因?yàn)檫@可能會(huì)導(dǎo)致較差的類器官的生長(zhǎng)甚至破壞。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)，如果是小塊細(xì)胞的混合物，可以觀察到由10-50個(gè)細(xì)胞組成的細(xì)胞團(tuán)，消化就完成了。

5. 消化完成后，用1ml上皮類器官基礎(chǔ)培養(yǎng)基進(jìn)行一次沖洗，然后室溫下200g離心3分鐘。

6. 棄上清，用適量的基質(zhì)膠重懸類器官沉淀，重懸后置于冰上，重懸時(shí)間不超過(guò) 30s 以避免基質(zhì)膠過(guò)早凝固。

注意：基質(zhì)膠稀釋比例應(yīng)在 70%以上以保證培養(yǎng)過(guò)程中基質(zhì)膠的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性。

7. 將基質(zhì)膠和類器官的混合懸液點(diǎn)入 24 孔板底部正中央，避免懸液接觸孔板側(cè)壁，每孔 30uL 左右。

注意：為防止基質(zhì)膠室溫凝固，此步驟應(yīng)盡快完成。

8. 將接種完成后的培養(yǎng)板至于 37℃二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱中，孵育 15min 左右待基質(zhì)膠凝固。

9. 配制人肝膽管類器官穩(wěn)態(tài)培養(yǎng)基，并在37°C預(yù)熱。

10. 待基質(zhì)膠完全凝固后，加入已預(yù)熱的人肝膽管類器官培養(yǎng)基，24 孔板每孔 500uL。

11. 將 24 孔板置于 37℃二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，直到類器官需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)。